【摘要】
在快速診斷技術(shù)中，側(cè)流免疫層析法（LFA）因其便攜性、操作簡(jiǎn)便和快速出結(jié)果的特點(diǎn)而備受關(guān)注。但是，LFA的主要缺點(diǎn)是有限的敏感性和選擇性。為了解決這些問(wèn)題，研究人員已經(jīng)開發(fā)了多種創(chuàng)新策略，如樣本富集、分析條件優(yōu)化和信號(hào)放大。但是抗體定向問(wèn)題卻常常被忽略，而不適宜的定向可能會(huì)顯著降低檢測(cè)性能。
本文首先探討了傳統(tǒng)方法，比如細(xì)微的物理性調(diào)整和非特異性化學(xué)鍵的形成，然后重點(diǎn)討論了抗體定向固定在探針表面上，旨在通過(guò)利用蛋白質(zhì)間的親和力或互補(bǔ)的氨基酸序列從根本上提升檢測(cè)的靈敏度和選擇性。本文總結(jié)了抗體定向?qū)FA分析性能在靈敏度、特異性、檢測(cè)速度、可靠性、成本效益和穩(wěn)定性方面的影響。此外，文章還介紹了對(duì)檢測(cè)膜材料的最新改進(jìn)，并探討了LFA目前的局限性和未來(lái)的發(fā)展?jié)摿Α?/span>
LFA 具有多功能性，可在各種環(huán)境中應(yīng)用，包括實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)療中心和日常生活。COVID-19大流行期間，臨床資源分配不均和醫(yī)務(wù)人員短缺加劇了混亂，導(dǎo)致疫區(qū)擴(kuò)大和死亡率上升。這凸顯了對(duì)快速、中等準(zhǔn)確度的市售診斷工具的需求。LFA提供了一種便攜、負(fù)擔(dān)得起且無(wú)需專業(yè)的診斷解決方案，能在半小時(shí)內(nèi)提供結(jié)果，相比于需要數(shù)小時(shí)到數(shù)天的PCR檢測(cè)，具有明顯優(yōu)勢(shì)。盡管LFA存在不足，但表現(xiàn)出 37.7% 至 99.2% 的靈敏度和超過(guò) 92% 的選擇性，超越了家庭自我診斷。然而，隨著LFA的普及，對(duì)其敏感性和選擇性的擔(dān)憂也在增加，假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果仍然是一個(gè)問(wèn)題。
圖1.RT-PCR 與當(dāng)前 LFA 的比較
傳統(tǒng)提高LFA選擇性和靈敏度的方法可分為內(nèi)部和外部修飾，內(nèi)部修飾側(cè)重于改善 LFA 系統(tǒng)內(nèi)的化學(xué)相互作用，例如使用基于聚合物的 LFA 通過(guò)疏水效應(yīng)促進(jìn)蛋白質(zhì)接枝，實(shí)施 3D 生物接頭，通過(guò)增加表面積來(lái)減少空間位阻和控制流體流速，以及添加額外的共軛墊以允許多層納米顆粒 （NP） 共軛，從而增強(qiáng)比色信號(hào)強(qiáng)度。外部修飾主要針對(duì)信號(hào)或讀數(shù)的表達(dá)。包括：（i） 調(diào)整金納米顆粒 （AuNP） 的大小，（ii） 優(yōu)化接頭的長(zhǎng)度，（iii） 應(yīng)用電活性標(biāo)簽，以及 （iv） 增強(qiáng)視覺信號(hào)。前兩種策略側(cè)重于放大表面等離子體共振 （SPR），而后兩種策略旨在改進(jìn)使用電信號(hào)、化學(xué)發(fā)光、比色法或量子點(diǎn)的檢測(cè)方法。此外，磁性可用于樣品定位和預(yù)濃縮。這些修改通常優(yōu)先考慮分析的進(jìn)步和樣品富集，相對(duì)于 PCR，LFA 的固有優(yōu)勢(shì)可能會(huì)受到影響，例如檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單和樣品預(yù)處理要求最低。傳統(tǒng)方法的主要目標(biāo)是提高結(jié)合效率，這是實(shí)現(xiàn)正確探針?lè)较虻慕Y(jié)果。
抗體方向的修飾策略是膜工程和探針修飾。從本質(zhì)上講，固定化利用（生物）化學(xué)來(lái)最大限度地暴露有效結(jié)合位點(diǎn)，從而提高結(jié)合效率。無(wú)論是將探針錨定在納米顆粒、特定分析物還是測(cè)試和控制線上，定向固定都通過(guò)最大限度地暴露結(jié)合位點(diǎn)來(lái)確保安全和精確的結(jié)合。在這種情況下，LFA 保持了其檢測(cè)時(shí)間短、復(fù)雜性低和樣品預(yù)處理要求最低的標(biāo)志性特征。此外，由于捕獲-分析物復(fù)合物數(shù)量的增加，實(shí)現(xiàn)了更高的靈敏度或選擇性。雖然定向固定背后的理論看起來(lái)很簡(jiǎn)單，但實(shí)際操作具有一定復(fù)雜性。在這些方法中誘導(dǎo)形成的化學(xué)鍵的能量較弱，對(duì)實(shí)現(xiàn)定向固定仍有一定困難。對(duì)于固定效率較高的方法，在費(fèi)用、時(shí)間和精力方面成本可能較高。將蛋白質(zhì)作為助手是一把雙刃劍。一方面，由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的特異性相互作用，適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)可以定向引導(dǎo)探針。另一方面，由于蛋白質(zhì)具有生物活性，因此必須仔細(xì)考慮環(huán)境條件、對(duì)靶標(biāo)的親和力以及與其他官能團(tuán)的交叉活性等因素。
實(shí)現(xiàn)高靈敏度和選擇性對(duì)于實(shí)現(xiàn)即時(shí)診斷的概念至關(guān)重要。目前，抗體固定方法可分為兩種主要類型：非共價(jià)修飾和共價(jià)修飾。無(wú)論采用何種原理，主要目標(biāo)是最大限度地提高結(jié)合位點(diǎn)的暴露，以最大限度地提高 LFA 的靈敏度和選擇性。當(dāng)抗體附著在 LFA 的膜表面時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)四種類型的排列。其中，“end on”方向被認(rèn)為更優(yōu)越，因?yàn)樗蟪潭鹊乇┞读?Fab 片段上的結(jié)合位點(diǎn)，從而顯著提高了有效結(jié)合的可能性。因此，專注于調(diào)整抗體以實(shí)現(xiàn)末端定向的努力已成為一個(gè)重點(diǎn)。
圖2.抗體附著在 LFA 的膜表面四種類型的排列
實(shí)現(xiàn)抗體定向的方法多種多樣，其中物理吸附因其簡(jiǎn)單直觀而最常用。物理吸附通過(guò)非共價(jià)相互作用，如疏水效應(yīng)、氫鍵、靜電相互作用和范德華力，利用探針、納米顆粒和平臺(tái)材料的表面特性來(lái)固定化抗體，而不顯著改變分子的電子結(jié)構(gòu)。然而，物理吸附形成的化學(xué)鍵較弱，導(dǎo)致抗體的固定不夠有效或定向。為了實(shí)現(xiàn)更精確和完全的抗體固定，已經(jīng)開發(fā)了多種修飾方法，可以分為探針修飾和膜修飾兩大類。探針修飾可以是非共價(jià)或共價(jià)的，取決于化學(xué)鍵的類型。而膜修飾則涉及測(cè)試線、控制線以及試紙底物成分的修改。
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探針修飾
1.1非共價(jià)鍵合
在 LFA 中，通常使用兩種彼此具有高親和力的蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)定向固定。
圖3.LFA 中使用的蛋白質(zhì)之間非共價(jià)鍵的典型類型
蛋白 A、蛋白G 和蛋白 A/G 是廣泛用于固定某些免疫球蛋白的蛋白質(zhì)。Sotnikov 等人開發(fā)了一種基于常規(guī)類型的高級(jí)二期 LFA。在免疫層析血清學(xué)診斷初始階段利用金納米顆粒與葡萄球菌免疫球蛋白結(jié)合蛋白 A 和固定在工作膜上的抗原偶聯(lián)。在后續(xù)階段，引入了一種標(biāo)記的免疫球蛋白結(jié)合蛋白加強(qiáng)結(jié)合免疫復(fù)合物的著色。這種兩步法顯著減少了非特異性免疫球蛋白對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。使用 SARS-CoV-2 的重組 RBD 蛋白進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試區(qū)著色強(qiáng)度增加了兩個(gè)數(shù)量級(jí)以上，假陰性結(jié)果顯著減少。LFA 的診斷敏感性從傳統(tǒng)格式的 62.5% 提高到增強(qiáng)格式的 100%。在 Kim 的研究中，對(duì)使用蛋白 G 將抗體定向固定在磁珠上與使用胺基隨機(jī)固定進(jìn)行比較。盡管定向固定化的偶聯(lián)物濃度較低，但在較高的靶標(biāo)濃度下觀察到更大的信號(hào)增強(qiáng)。這表明使用定向固定技術(shù)確實(shí)可以提高敏感性。除了直接應(yīng)用蛋白質(zhì) A 和蛋白質(zhì) G 外，還可以采用交聯(lián)技術(shù)。Choi 和他的團(tuán)隊(duì)對(duì)蛋白 G 進(jìn)行了基因工程改造，使其在 C 端包含兩個(gè)半胱氨酸殘基。這種修飾使半胱氨酸上的巰基能夠自組裝到金表面上，從而大大增強(qiáng)了金板的熒光性能。
圖4.蛋白 A 或蛋白 G 的幫助下進(jìn)行抗體定向固定。（A） 蛋白 A 促進(jìn)第二階段 LFA：（i） 擬議的增強(qiáng)型血清診斷 LFA 方案和 （ii） 含有 0 （1）、0.003 （2）、0.01 （3）、0.03 （4）、0.1 （5） 的樣品的普通（左圖）和增強(qiáng)（右圖）LFA 后的試紙照片， 0.3 （6）、1 （7）、3 （8） 和 10 （9） μg mL−1的 MAb RBD5313。（B） 以隨機(jī)（左）和定向（右）方式將抗體固定在磁珠上。（C-i）半胱氨酸修飾蛋白 G 將 IgG Fc 結(jié)合結(jié)構(gòu)域修飾和 IgG 固定在金表面的示意圖。（C-ii） 固定在 PBS 處理的金（左）、野生型蛋白質(zhì)處理（中）和半胱氨酸修飾的蛋白G 處理（右）金表面的 Cy3 標(biāo)記抗體的熒光顯微鏡分析。
1.1.2生物素-（strept）親和素相互作用
鏈霉親和素與捕獲探針預(yù)孵育可以導(dǎo)致鏈霉親和素復(fù)合物的多方向固定，這為生物素化檢測(cè)探針提供了結(jié)合位點(diǎn)。Nichols及其同事成功地應(yīng)用這種方法檢測(cè)了SARS-CoV-2。Wu的團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種基于BioAb/SA-BSA/MPA/AuNS/SPCE的免疫傳感器，專門用于檢測(cè)SARS-CoV-2。這項(xiàng)研究開發(fā)了一種基于無(wú)標(biāo)記電化學(xué)阻抗譜（EIS）的免疫傳感器，利用金納米結(jié)構(gòu)絲網(wǎng)印刷碳電極（AuNS/SPCE）來(lái)檢測(cè)唾液中的SARS-CoV-2核衣殼蛋白（N蛋白）。通過(guò)使用短鏈3-巰基丙酸（MPA）作為接頭，將鏈霉親和素（SA）和牛血清白蛋白（BSA）共價(jià)鍵合，以控制生物素化抗N蛋白抗體（BioAb）的定向固定化。展現(xiàn)出更高的靈敏度、更低的檢測(cè)限（LOD）和高度特異性。這表明通過(guò)使用BSA將抗體固定在各種材料上可以改進(jìn)病毒檢測(cè)的潛力。
圖5.在生物素-親和素相互作用的幫助下進(jìn)行抗體定向固定。（A-i）通過(guò)引入生物素-親和素化學(xué)技術(shù)開發(fā)半條帶 LFA，用于檢測(cè) SARS-CoV-2。（A-ii）通過(guò)使用從 Genemedi 和 Genscript 獲得的兩種市售 SARS-CoV-2 核衣殼 （N） 蛋白，為半條帶 LFA 生成的劑量-反應(yīng)曲線。（B-i）顯示基于 AuNS/SCPE 的免疫傳感器制造的步驟，包括用 MPA 修飾 AuNS/SPCE、用EDC/NHS 激活、SA-BSA 的固定化、BioAb 的固定化，最后是 N 蛋白免疫反應(yīng)。（B-ii）BioAb/SA-BSA/MPA/SPCEs對(duì)各種分析物的特異性性能。
為了提高定向固定化效率，利用抗體上存在的特定官能團(tuán)如胺基，羧基，二硫鍵，和Fc 區(qū)鉸鏈結(jié)構(gòu)域中的可修飾碳水化合物部分。與物理吸附相比，共價(jià)鍵固定化方法具有優(yōu)異的鍵強(qiáng)度，從而提高了固定化效果。
圖6.調(diào)節(jié)抗體方向的共價(jià)鍵策略。（A） 抗體結(jié)構(gòu)和功能性 Fc 和 Fab 區(qū)域?？贵w和探針之間的共價(jià)鍵合反應(yīng)，包括 （B） 羧酸-胺、（C） 二硫鍵裂解和 （D） 碳水化合物反應(yīng)。
1.2.1胺和羧基官能團(tuán)之間的偶聯(lián)
最常用的方法包括通過(guò) EDC/NHS 偶聯(lián)形成酰胺鍵。有團(tuán)隊(duì)通過(guò) EDC/NHS 成功實(shí)現(xiàn)了抗體與 AIE 發(fā)光原 （AIEgens） 的偶聯(lián)，從而能夠目視檢測(cè) SARS-CoV-2 的受體結(jié)合域 （RBD） 和 N 抗原。該方法的檢測(cè)限較低，低至 6.9 ng mL−1用于 RBD 蛋白和 7.2 ng mL−1對(duì)于具有高特異性的 N 蛋白。Chan 的小組使用與4,7,10-三氧雜-1,13-十三烷二胺（一種靈活的二胺-PEG接頭）作為接頭，將聚合物與抗體偶聯(lián)，抗體可以定位與靶抗原結(jié)構(gòu)域?qū)R，特異性結(jié)合親和力顯著增加。
圖7.在胺基和羧基的幫助下改變抗體方向。（A-i）基于 AIEgen 的試紙的配置和檢測(cè)機(jī)制示意圖。（A-ii）0、0.001、0.01、0.1、1、10 和 20 μg mL 試紙?jiān)?365 nm 光照射下的試紙圖像−1PBS 中的 RBD（左）和 N（中）蛋白。右圖：與含有 1 μg mL不同抗原（AFP、HCG、CEA、CA125、HSA、S2 蛋白、RBD 蛋白、FBS、CRP 和 N 蛋白）的樣品反應(yīng)后，試紙?jiān)?365 nm 光照射下的圖像−1).（B-i）示意圖顯示了在探針表面實(shí)現(xiàn)抗體功能化的傳統(tǒng)方法。（B-ii）修飾二胺作為探針表面和抗體之間的接頭。底部面板顯示了與含有 0 或 5 ng mL 的樣品反應(yīng)后的試紙照片−1的 PSA 抗原。
存在于抗體鉸鏈區(qū)的二硫鍵也可以促進(jìn)固定。Jeong 等人通過(guò)馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)，使抗體與硅納米顆粒的結(jié)合增加了大約 8 倍。由于實(shí)現(xiàn)了適當(dāng)?shù)亩ㄏ?，巰基固定化抗體的使用表現(xiàn)出卓越的特異性靶向能力。例如，使用雙金偶聯(lián)物開發(fā)了唾液樣本中 SARS-CoV-2 刺突 1 （S1） 抗原的快速檢測(cè)平臺(tái)，以增強(qiáng)信號(hào)。在這項(xiàng)研究中，金標(biāo)記的抗 S1 納米抗體 （Nbs） 作為 S1 檢測(cè)器偶聯(lián)物，而金標(biāo)記的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 2 （ACE2） 作為 S1 捕獲偶聯(lián)物（圖4A）。在循環(huán)閾值 （Ct ≤ 30） 的陽(yáng)性樣本的早期檢測(cè)中，與 mAb 基試紙條相比，基于 Nbs 的LFT 試紙條表現(xiàn)出更高的靈敏度 （97.14%） 和特異性 （98.57%）（圖 4B），為在易于收集的唾液樣本中快速篩查 SARS-CoV-2 S1 抗原提供了靈敏的診斷工具。
圖8.（A） 示意圖說(shuō)明了用于檢測(cè)唾液樣本中 SARS-CoV-2 S1 抗原的增強(qiáng)型夾心 LFA。（B） 使用 Nbs 或 mAb 的增強(qiáng)型 LFA 試紙條中的顏色強(qiáng)度與唾液樣本中病毒拷貝數(shù)之間的關(guān)系。
Daniele 和 Menegatti的小組通過(guò)碳水化合物固定實(shí)現(xiàn)了信號(hào)放大，這種通過(guò) Fc 碳水化合物基團(tuán)的位點(diǎn)特異性方法降低了偶聯(lián)異質(zhì)性，并增加了正確定向 IgG 檢測(cè)器偶聯(lián)物的可能性。Lin 等人使用環(huán)狀硼酸二酯與捕獲抗體上的碳水化合物定向結(jié)合，用于凝集素檢測(cè)，構(gòu)建了一個(gè)微陣列平臺(tái)。銀增強(qiáng)圖像表明，以定向方式固定的抗體微陣列產(chǎn)生了清晰且均勻的陣列?？贵w在微陣列上的定向顯著提高了檢測(cè)靈敏度。與隨機(jī) NHS 化學(xué)固定化獲得的檢測(cè)結(jié)果相比，檢測(cè)結(jié)果明顯更亮，說(shuō)明了抗體定向的重要性。
圖9.在碳水化合物的幫助下進(jìn)行抗體定向固定。（A-i）示意圖顯示了以量子點(diǎn)作為信號(hào)報(bào)告基因的側(cè)向?qū)游鰥A心免疫測(cè)定?？贵w和量子點(diǎn)之間通過(guò)碳水化合物基團(tuán)的偶聯(lián)是通過(guò)氧化抗體 Fc 區(qū)的糖基化區(qū)域來(lái)實(shí)現(xiàn)的。（A-ii）普通 EDC 偶聯(lián)和碳水化合物氧化后還原胺化對(duì)分析物的信號(hào)響應(yīng)比較。（B-i）用于凝集素傳感測(cè)定的基于糖納米顆粒的定向抗體微陣列的示意圖。（B-ii）通過(guò)硼酸鹽形成定向固定和隨機(jī)酰胺鍵形成制備的捕獲抗體之間的檢測(cè)性能比較。
除了用于抗體定向的探針修飾外，與探針相比，促進(jìn)毛細(xì)管效應(yīng)的膜經(jīng)常被忽視。LFA 膜的結(jié)構(gòu)包括硝酸纖維素膜和涂層測(cè)試/對(duì)照線，其中兩種組合物也可以進(jìn)行定向修飾。這類技術(shù)包括成熟的蛋白質(zhì)預(yù)包被和新開發(fā)的纖維素材料。
2.1測(cè)試線和控制線的修飾
蛋白A和蛋白G不僅可以與抗體探針偶聯(lián)，還能用于修飾檢測(cè)線和控制線，結(jié)合位點(diǎn)朝外，以提高靈敏度。在實(shí)驗(yàn)中，使用蛋白G預(yù)包被的檢測(cè)線能夠有效捕獲抗體復(fù)合物，并在高樣品稀釋下保持良好檢測(cè)限。Cai 等人用蛋白 G 預(yù)包被測(cè)試線，當(dāng)抗原存在時(shí)，能夠定向捕獲抗 rSjSAP4 抗體復(fù)合物。該設(shè)備表現(xiàn)出令人滿意的檢測(cè)限，即使在 320 倍樣品稀釋下，R 值仍保持在 1 以上。但在高濃度血清樣品中，非特異性抗體結(jié)合可能導(dǎo)致結(jié)果降低。
圖11.（A） 使用預(yù)包被的重組蛋白 G 修飾測(cè)試線，用于定向抗體固定。（B） 稀釋液的檢測(cè)限范圍為 1：5至 1：40690，通過(guò)引入 Kato Katz 陽(yáng)性參與者的混合血清樣品。據(jù)報(bào)道，檢出限為 1：20480。C：控制線;T：測(cè)試線;NC，來(lái)自非流行對(duì)照的混合血清樣品，以 1：5的稀釋度測(cè)試。
鏈霉親和素或生物素作為捕獲探針直接包被在檢測(cè)線上，能有效增強(qiáng)LFA的性能。與傳統(tǒng)LFA相比，這種方法提供了更長(zhǎng)的保質(zhì)期、增強(qiáng)的信號(hào)及識(shí)別DNA和RNA序列的能力。此外，鏈霉親和素預(yù)包被的條帶還可以定向固定生物素化的納米抗體（Nbs），后者相較于傳統(tǒng)抗體更小，降低了無(wú)定向結(jié)合的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)具有更好的抗熱和化學(xué)變性能力。Magez團(tuán)隊(duì)利用生物素化的納米抗體開發(fā)了針對(duì)剛果錐蟲的LFA，發(fā)現(xiàn)與鏈霉親和素包被的測(cè)試線結(jié)合的性能優(yōu)于直接沉積的納米抗體。在優(yōu)化分析緩沖液后，靈敏度得到了顯著提高。盡管LFA在小鼠和牛的測(cè)試中表現(xiàn)出一定的假陰性率，研究者們提出使用帶有 AuNP （Nb44–Nb44–AuNPs） 的二價(jià)捕獲納米抗體來(lái)增強(qiáng)親和力和信號(hào)放大，有望克服這一局限性。
圖12.（A） 針對(duì)剛果錐蟲的基于 Nb 的 LFA 的設(shè)計(jì)。（B） 加標(biāo) PBS 的檢測(cè)限 TcoPYK：Nb42 包被測(cè)試線 （0.88 μg ml−1，左）和生物素化 Nb42 包被的測(cè)試線 （0.22 μg ml−1，右）。（C） 加標(biāo)稀釋系列 TcoPYK 的幼稚牛血清的檢測(cè)限：使用單價(jià) Nb44-AuNPs（0.88 μg ml−1，左）和二價(jià) Nb44–Nb44–AuNPs（0.11 μg ml−1，右）作為捕獲抗體。
核酸的固定化通常使用生物素、鏈霉親和素或蛋白A和蛋白G等方法，這些間接方法需額外的預(yù)孵育步驟，影響成本效益和時(shí)間效率。在Bruylants的研究中，使用BSA固定的p14肽適配體成功檢測(cè)癌癥生物標(biāo)志物Mdm2，表現(xiàn)出比傳統(tǒng)抗體系統(tǒng)更高的靈敏度和穩(wěn)定性。此外，開發(fā)的自組裝四面體DNA納米結(jié)構(gòu)（TDN）提高了固定探針的方向性和密度，減少了空間位阻。Zuo等人利用TDN開發(fā)的金電極平臺(tái)顯著提高了對(duì)PSA的檢測(cè)限，歸因于適當(dāng)?shù)奶结橀g距。TDN還被用于側(cè)向?qū)游鲈嚰垼軌蛴行z測(cè)外泌體miRNA-150-5p，顯示出良好的靈敏度和選擇性。盡管TDN技術(shù)具有潛力，但仍需簡(jiǎn)化探針制造程序以實(shí)現(xiàn)真正的POC工具。
圖13.（A） 基于靶向外泌體 vmicroRNA-150-5p 的 DNA 四面體包被條帶的比率式 LFA 設(shè)計(jì)。（B） 應(yīng)用 0、10 進(jìn)行靈敏度測(cè)試−13, 10−12, 10−11, 10−10, 10−9和 10−8miR-150-5p 的 M（左）。LOD 為 0.9921，基于靈敏度測(cè)試的數(shù)據(jù)（右）得出。（C） 通過(guò)引入 miR-150-5p、單堿基錯(cuò)配 miR-150-5p、雙堿基錯(cuò)配 miR-150-5p、隨機(jī) miRNA 和 miR-21 進(jìn)行選擇性檢測(cè)（相應(yīng)地是 b-f 組。組 a 為空）（左）。當(dāng)用 miR-150-5p 處理時(shí)，比率裝置的 T/C 比值顯著升高，b 組 （右）。
2.1.4兩親性疏水素 （HFBI） 蛋白
抗體在多孔硝酸纖維素膜測(cè)試線上的生物活性對(duì)分析靈敏度至關(guān)重要。傳統(tǒng)的噴涂方法常導(dǎo)致抗體隨機(jī)取向和多層疊加，損失生物活性。Zhang等人采用了兩親性疏水素（HFBI）來(lái)促進(jìn)PSA抗體的有序自組裝，確?？贵w以“立式”取向固定在測(cè)試線。該方法的檢測(cè)限低至0.06 ng/mL，比傳統(tǒng)方法提高了靈敏度，并獲得了良好的校準(zhǔn)曲線（決定系數(shù)0.965）。特異性測(cè)試顯示，僅在PSA組中有顯著熒光信號(hào)。HFBI修飾的LFA在150份臨床血清樣本中的檢測(cè)結(jié)果與電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定一致，驗(yàn)證了其準(zhǔn)確性。
圖14.（A） 傳統(tǒng)和HFBI 修飾的 LFA 的示意圖比較。（B） 用于檢測(cè) PSA 靶標(biāo)的 HFBI 修飾和未修飾FICT 的 LOD（左上）。敏感性測(cè)試（左下）：通過(guò)處理 0、0.2、1、2、5 和 12 ng mL 的 PSA 靶標(biāo)，目視讀取 HFBI 修飾的 FICTS−1分別。選擇性試驗(yàn)（右）：HFBI 修飾的 LFA 與不同抗原反應(yīng)后。
2.2膜的改性
為了改善方向控制，已經(jīng)引入了基于纖維素的 LFA。纖維素基材（例如濾紙、棉纖維和纖維素纖維）具有更高的柱床體積和更強(qiáng)的非特異性結(jié)合抵抗力，從而提高了靈敏度。碳水化合物結(jié)合模塊 （CBM） 是在許多碳水化合物活性酶中發(fā)現(xiàn)的不同蛋白質(zhì)片段，它們能夠結(jié)合多種碳水化合物，從二糖和低聚糖到纖維素等多糖，具有高選擇性和特異性。França Prazeres 的小組首先制備了一種傳統(tǒng)的 LFA 形式，它依賴于捕獲抗體在 NC 膜測(cè)試線上的隨機(jī)吸附，與由 ZZ-CBM3 融合修飾的 LFA 進(jìn)行比較。結(jié)果表明，當(dāng)使用纖維素作為涂層時(shí)，熒光線通常更粗、更強(qiáng)烈，并顯示出更大的像素體積。這種線粗增加歸因于生物素-BSA 溶液在纖維素層上的橫向擴(kuò)散增強(qiáng)，證實(shí)了纖維素涂層有效地作為 ZZ-CBM3 融合的錨點(diǎn)。另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)比較了在 LFA 測(cè)試線上分配蛋白 A 和ZZ-CBM3 融合對(duì) Alexa 標(biāo)記抗體的捕獲能力。在 NC + 纖維素條帶中觀察到的 ZZ-CBM3 融合強(qiáng)度更高，這可歸因于 ZZ 結(jié)構(gòu)域在融合中提供的更有利的方向。
圖15.（A） 傳統(tǒng)NC 膜與在 LFA 中涂覆 ZZ-CBM 熔融膜的比較。（B-i）NC 條帶上的纖維素涂層對(duì)生成信號(hào)的熒光強(qiáng)度的影響。（B-ii）在 LFA 測(cè)試線上通過(guò)蛋白A 和 ZZ-CBM3 融合對(duì) Alexa 標(biāo)記抗體的捕獲效率進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)在測(cè)試線上使用 NC 條帶和添加纖維素層 （NC + cel） 的 NC 條帶。
Kolmar 和Schwall 等人開發(fā)了單鏈可變片段 （scFv） 或全長(zhǎng)抗體 （IgG） 與來(lái)自熱梭菌纖維素骨架支架的 CBM3a 結(jié)構(gòu)域的遺傳融合。這種方法顯著提高了纖維素結(jié)合載量，與使用裸 scFvs 或 IgG 的側(cè)向?qū)游鲅b置相比，該方法提高了基于纖維素的側(cè)向?qū)游鲅b置的靈敏度和整體性能。
圖16.（A） 使用毛細(xì)管流速約為 60 s/4 cm （C60） 的纖維素紙檢測(cè) hCG 的纖維素基 LFA。使用CBM 抗 hCG scFv 或單獨(dú)抗 hCG scFv 修飾測(cè)試線。（B） 用于檢測(cè)血清樣品中 SARS-CoV-2 特異性抗體的纖維素基 LFA，檢測(cè)線涂有 CBM-抗-Fc scFv、抗 hIgG-CBM、抗 Fc scFv 或抗 hIgG 作為檢測(cè)抗體。
Kim 的小組開發(fā)了一個(gè)比色 LFA 平臺(tái)，用于使用雙功能融合接頭 CBP31-BC 進(jìn)行早期 SARS-CoV-2 檢測(cè)。該接頭結(jié)合了纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)和抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以將抗體定向到纖維素膜上。測(cè)試區(qū)的特點(diǎn)是在測(cè)試線上將 CBP31-BC 與抗 SARS-CoV-2 RBD 抗體預(yù)孵育，在對(duì)照線上單獨(dú)使用 CBP31-BC。將 CBP31-BC 與捕獲抗體的最佳摩爾比確定為 1：20，以最大限度地減少檢測(cè)抗體在金納米顆粒上的非特異性吸附?；?CBP31-BC 的 LFA 使用來(lái)自 SARS-CoV、MERS-CoV和 CoV-H229E 的 S1 抗原對(duì) SARS-CoV-2 抗原表現(xiàn)出高度特異性。該平臺(tái)的實(shí)用能力使用培養(yǎng)的SARS-CoV-2 樣本進(jìn)行評(píng)估，顯示視覺敏感性和 5 × 10 的 LOD5每毫升拷貝數(shù)。此外，使用 COVID-19 患者 （n = 16） 和健康受試者 （n = 3） 的鼻咽拭子樣本證實(shí)了 LFA 的性能，顯示出與 RT-qPCR 結(jié)果的高度一致性。
圖17.（A） 用于檢測(cè) SARS-CoV-2 的基于 CBP31-BC 的 LFA 示意圖。（B）SARS-CoV-2 RBD、SARS-CoV S1、MERS-CoV S1 和 CoV-H229E S1 抗原的 LFIA 標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)試線強(qiáng)度，虛線表示無(wú)樣品。（C） 各種培養(yǎng)的 SARS-CoV-2 濃度的 LFA 試紙的攝影圖像和歸一化測(cè)試線強(qiáng)度，黑色虛線表示臨界值（3 個(gè)空白樣品的平均值 + 3 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差）。（D） 使用COVID-19 患者的鼻咽拭子樣本與 PCR 結(jié)果的 LFA 性能比較。
但是在以上方法中仍然存在一些問(wèn)題，例如蛋白質(zhì)之間交叉反應(yīng)性引起的定向固定化減少，生物識(shí)別蛋白結(jié)構(gòu)域可能與其他抗體片段結(jié)合或與非靶標(biāo)分析物反應(yīng)，纖維素膜上熒光在測(cè)試線和對(duì)照線上的擴(kuò)散等等，這些問(wèn)題仍有待解決。
2.2.2纖維素納米纖維改性生產(chǎn)線
近年來(lái)，在 LFA 中添加纖維素納米纖維 （CNF） 層已成為一種旨在提高靈敏度的成熟技術(shù)。CNF 具有較小的孔徑，可增強(qiáng)孔隙率、表面積和暴露的羥基數(shù)量，間接提高了靈敏度。然而，這種方法主要依賴于物理吸附，與 CBM 融合策略相比，物理吸附對(duì)抗體固定的效果較差。此外，CNF 產(chǎn)生的致密表面會(huì)阻礙樣品遷移，從而降低重現(xiàn)性。Merkoçi 的小組發(fā)現(xiàn)，CNF 凝膠增加了紙張表面附近抗體的密度，從而通過(guò)在陽(yáng)性樣品上保留更多報(bào)告探針來(lái)增強(qiáng)信號(hào)。CNF 用于穿透硝酸纖維素紙的孔隙，僅減小測(cè)試區(qū)域的孔徑，增加了測(cè)試線區(qū)域中選擇性連接的金納米顆粒的密度，并將靈敏度平均提高了 36.6%。這種改性簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)高效，并且可以輕松應(yīng)用于任何類型的 LFA 試紙條，使其適用于即時(shí)應(yīng)用。
圖18. (A） 未改性的陽(yáng)性測(cè)試線（上圖）和分配纖維素納米纖維改性的陽(yáng)性測(cè)試線的示意圖（下圖）。Merkoçi 教授通過(guò)引入纖維素納米纖維的 LFA。（B） 在測(cè)試線上應(yīng)用和不應(yīng)用 CNF 的LFA 的攝影圖像（上圖），HIgG 為 0、0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、0.75 和 1.00 μg ml−1.條形圖（下圖）用于比較信號(hào)增強(qiáng)的百分比。
【小結(jié)】
在側(cè)向流檢測(cè)（LFA）中提升靈敏度和選擇性至關(guān)重要，重點(diǎn)是抗體定向固定。包括物理調(diào)整、共價(jià)鍵形成、非共價(jià)鍵形成、纖維素基膜和纖維素納米纖維涂層。傳統(tǒng)方法（如物理調(diào)整和共價(jià)鍵形成）存在交互作用弱和操作復(fù)雜的問(wèn)題，而非共價(jià)鍵形成雖具有生化特異性，但面臨蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)性等困難。較新的CBM主導(dǎo)的生物識(shí)別方法也存在類似問(wèn)題。此外，纖維素涂層能增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度，但仍存在線路擴(kuò)散和無(wú)方向固定的挑戰(zhàn)。
除了討論的常規(guī)和新型固定技術(shù)外，將捕獲探針連接、存放或涂覆到 T/C 線上的方法也經(jīng)常被忽視。本文旨在解決和改進(jìn)噴涂過(guò)程中導(dǎo)致的隨機(jī)固定，如果檢測(cè)線本身在其組合中沒有正確定向，則后續(xù)捕獲和識(shí)別探針層也將缺乏正確的方向。總之，盡管迄今為止開發(fā)了許多技術(shù)，但沒有一項(xiàng)技術(shù)完全達(dá)到理想的 POC 標(biāo)準(zhǔn)。LFA 在靈敏度和選擇性方面仍有很大的改進(jìn)空間。此外，成本和全球可用性是減輕經(jīng)濟(jì)和人員負(fù)擔(dān)需要關(guān)注的關(guān)鍵因素。因此，化學(xué)工程、聚變技術(shù)和生物分子探索方面的進(jìn)步是需要進(jìn)一步努力和研究的領(lǐng)域。
Lu Z Y, Chan Y H. The importance of antibody orientation for enhancing sensitivity and selectivity in lateral flow immunoassays[J]. Sensors & Diagnostics, 2024.
原文鏈接：https://doi.org/10.1039/D4SD00206G
